高分子物理實驗教學中凝膠色譜法常見問題分析
發布時間：2020-09-13作者：lht來源：點擊： 次
凝膠滲透色譜 (gel permeation chromatography, GPC) 是一種近幾十年才發展起來的新型液體色譜, 由美國學者J.C.Moore 于1964年首先研究成功[1]。GPC的分離原理是基于溶液中分子體積 (流體力學體積) 的大小。GPC接上不同的檢測器, 可以同時測定聚合物的各種相對分子質量及其分布, 在食品質量鑒定、農藥殘留分析以及對生物組織、谷物、植物和環境樣品進行凈化處理[2]等眾多領域中應用廣泛。凝膠色譜法是高校實驗教學中一種快速的分子量和分子量分布測定法, 被譽為近年來分子量分布測定技術中的一項重要突破。在GPC實驗中, 經常會遇到各種問題, 合理分析這些問題, 無疑對本科生教學意義重大。
1建立GPC裝置中的問題
品型凝膠色譜儀由輸液系統 (包括溶劑貯存器、脫氣系統、輸液泵、進樣器以及各種調節泵、壓力表等) 、色譜柱、濃度檢測器、分子量檢測器以及一些附屬電子儀器組成[3]。在本科生實驗教學中, 為了培養學生的實際動手能力、鼓勵學生積極思考, 在有限的實驗室條件下, 我們建立了自組裝GPC裝置。本套儀器將使本科生對凝膠色譜測分子量及分子量分布的原理和操作有更深層次的理解和掌握, 對擴展實驗室的硬件設備和提高高分子物理理論分析水平等方面有相當重大的意義, 并為本科生實驗的全面性組建貢獻力量。
2凝膠相關問題的分析
凝膠是凝膠色譜的核心, 是產生分離作用的基礎。凝膠固定相包括具有確定孔徑的有機和無機凝膠兩大類。根據凝膠使用的強度性質, 又把凝膠分成軟膠、半硬膠和硬膠三大類。常用的凝膠包括硅膠、葡萄糖、丙烯酸酯、聚苯乙烯等。不同的凝膠在性能、使用及裝柱方法等方面有著明顯的差異。進行凝膠色譜實驗時十分重要的一環就是選擇和搭配具有不同孔徑、色譜性能良好的凝膠。
2.1凝膠類型的選擇
在本實驗中首先選用了無機多孔硅膠[4], 硅膠粒徑通常為5～10 μm。無機多孔硅膠一般為硬膠。硬膠雖然有很多優點, 但是最大的問題在于本身含有殘留的活性點, 容易引起吸附效應, 導致分離機里的情況復雜化。吸附效應在凝膠色譜實驗中經常出現, 嚴重的情況是進行實驗時, 進樣以后試樣被完全吸附在色譜柱上得不到分析結果, 一般的現象是使色譜峰有很長的拖尾, 峰尖位置也向后挪動。數值計算時Mw、Mn偏低, Mw、Mn偏大。吸附往往出現在凝膠有極性基團。為了應盡可能消除吸附等副作用, 本實驗使用的多孔硅膠是經由廠家表面處理過的, 盡管如此, 實驗中發現峰拖尾現象還是很嚴重, 其中吸附效應無疑是主要的影響因素。
2.2凝膠的選擇指標
除了要求有良好的化學穩定性和熱穩定性、有一定的機械強度、不易變形、流動阻力小和對試樣的吸附作用較小外, 更要求載體的分離范圍越大越好。分離范圍是指V0和V0+Vi 2個淋出體積在分子量淋出體積曲線中對應的分子量之間的值, 它取決于載體的孔徑分布?？讖椒植荚綄? 則分離范圍也越寬[5]。為了加寬分離范圍, 可以用不同孔徑分布的載體混合裝柱, 或將裝有不同規格載體的色譜柱串聯使用。所以進行改進實驗時, 選擇2種孔徑的載體凝膠, 分別為以上所提到的無機硅膠和交聯聚苯乙烯凝膠 (粒度在10 μm) , 大大增加了色譜柱的分離范圍?；旌鲜褂脮r, 二者的混合比例則會成為影響分離效果和柱效的關鍵點, 所以要針對2種凝膠混合比例進行討論。通過這樣的延伸實驗, 使學生真正開動腦筋去思考, 同時加強對知識更深層次的理解。
3色譜柱技術問題的討論
高效的色譜柱作為凝膠色譜法的心臟, 最重要的指導原則就是:色譜柱應裝填得盡可能均勻和緊密, 在柱中沒有裂縫或溝槽, 也不發生柱的徑向或軸向凝膠的粒度不均勻分布。所以在色譜柱問題上, 不同的裝柱方法、裝柱高度和裝柱比例都會對色譜柱的整體性能和分離能力產生很大的影響。針對實際的柱子情況, 對這3點進行了討論。
3.1色譜柱材質的選擇
色譜柱的材質可以采用玻璃或不銹鋼, 根據不同用途和所要求的力學承載力決定[6]。工業應用中常采用不銹鋼材質的色譜柱, 而在實驗室中不需要很高的力學承載力, 因此常用玻璃的色譜柱。本校實驗定制的色譜柱是長約1.5 m的雙層玻璃管, 其中內管為實驗發生部分, 柱內壁均勻光滑, 內外管之間的空隙是為恒溫水浴設計的, 以避免外界環境溫度對柱效的影響。色譜柱上下均為14 mm標準口徑, 為增加其他配件提供了方便之處, 且玻璃透明, 能夠直觀地看到內管中凝膠的裝載情況, 發現裝柱的問題 (有無空氣空隙、有無明顯的密度梯度突變等) , 方便學生觀察理解。
3.2裝柱方法的探討
色譜柱的裝填可以分為干法裝柱和濕 (漿) 法裝柱2種[7], 在實驗中對2種裝柱方法均進行了嘗試, 以下為2種方法的裝柱過程和裝柱效果對比。
(1) 濕 (漿) 法裝柱。
觀察玻璃內管中凝膠的裝柱情況。柱中多次填裝的凝膠, 段與段間有明顯的空隙和斷層, 觀察到顏色深淺不一, 說明整體的密度不均, 效果不是很理想?？赡苡捎谀z的粒度過細且沒有高速勻漿法那樣的高壓強, 所以凝膠在溶劑中不易沉降, 在不同段之間產生密度梯度, 使整個色譜柱中凝膠松緊不一而影響柱效。
(2) 干法多次裝柱。
凝膠填裝完成后, 可以看到每次裝柱段間仍有明顯的間隙和斷層, 加入溶劑后, 段與段之間界面的差異更加明顯, 干法多次裝柱失敗。
(3) 干法一次裝柱。
不進行階段性敲打, 裝柱凝膠到達指定高度后, 一次性輕扣1 000次以上, 注意用力均勻, 然后用溶劑淋洗直至柱內空氣排空。觀察裝柱效果, 肉眼看, 柱內無明顯斷層和間隙, 且顏色均一, 證明密度較均勻。
對比以上3種裝柱方法, 決定應用干法一次裝柱法作為實驗的裝柱方法。
在裝柱時, 切記不能使用機械振動的辦法, 因為橫向振動將會引起玻璃管內凝膠粒度分離, 大顆粒將聚集在柱壁周圍, 而小顆粒將聚集在柱的中央。粒度分離必將導致凝膠的不均勻堆積, 引起峰加寬效應的加劇, 降低靈敏度。在加料和叩實的過程中用適當的棍條把凝膠壓實, 如果用力得當, 能使凝膠裝實而不致引起粒度分離, 效果會更好。
3.3裝柱高度的確定
凝膠在內層內的高度對分離的效果和色譜柱實驗可行性的影響都是需要討論的內容。對于色譜柱的分離效果, 經驗告訴我們, 柱越高, 分離效果越好, 但實際情況是, 由于本實驗沒有加壓裝置, 故溶液下滴的速度完全依賴凝膠對其的阻力而變化。不難想像, 柱越高, 溶液經過的路徑阻力就越大, 測量需要的時間越長, 所以在裝柱高度和實驗可行性之間有一個平衡點。雖然柱的高度越高分離效果越好, 但同時拖尾現象也越嚴重, 主要原因前面已經陳述過 (吸附效應等副反應) , 且溶劑的淋洗速度也隨柱高的增加而變慢。為了使設計更加人性化, 更加合理化, 同時也要考慮到玻璃管的力學承載能力。實驗中對可行性也進行了探討。需要設置不同裝柱高度的色譜柱進行實驗, 根據所得的結果進行選擇, 綜合各方面考慮, 最終確定一個比較合適的高度。
4溶劑的相關問題
4.1溶劑的選擇
進行實驗前, 首要的工作是選擇合適的溶劑。選用原則如下:
(1) 實驗工作者需要處理和接觸大量的溶劑, 因此要求溶劑毒性低、易純化、化學性質穩定;
(2) 溶劑應對樣品有很好的溶解能力, 最好是能夠溶解多種聚合物, 避免改變分析對象時更換溶劑, 尤其對于難溶的高分子樣品, 應使其充分溶解, 才能獲得良好的分離效果;
(3) 溶劑的黏度要盡可能小, 以減小流動阻力, 避免影響色譜淋洗速度, 因為在給定的線速度下, 色譜柱的壓降正比于溶劑的黏度;
(4) 溶劑的溶點要在室溫以下, 沸點要高于實驗溫度30°以上, 若沸點溫度較低, 有時在色譜柱中會產生氣泡, 干擾實驗結果;
(5) 為了保證比較高的檢測靈敏度, 溶劑還應與各種檢測器相匹配, 如果用示差折光儀檢測, 要求溶劑折光指數與被測試樣的折光指數有盡可能大的差別相差, 溶劑揮發量過大影響分光光度計的穩定性, 基線有較大波動, 即所謂的漂移現象, 影響實驗精度;
(6) 溶劑流動相應與柱中填充的凝膠固定相相互匹配, 能夠很好地浸潤凝膠, 可以有效地防止凝膠的吸附作用 (當采用軟質凝膠時, 溶劑應能使凝膠溶脹) 。
4.2溶劑的過濾
幾乎所有的溶劑在進行實驗前都必須使用0.45 μm (或0.22 μm) 濾膜過濾, 除去雜質微粒。因為雜質的存在, 可能導致柱效的降低。
4.3溶劑的貯存
溶劑一般貯存在玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼的容器內, 而不貯存在塑料的容器內。因為在GPC測試中, 很多時候使用有機溶劑。有機溶劑可能浸出塑料中的增塑劑, 導致溶劑本身被污染。容器應定期清洗, 以除去由于時間過長可能生長出的微生物。
綜合以上各方面的問題[8], 我們選用目前凝膠色譜中最常用的四氫呋喃為溶劑。四氫呋喃是很多塑料的良溶劑, 甚至是θ溶劑。淋出體積沒有濃度依賴性, 那么就可以消除由于濃度依賴性而增加的實驗工作量。本實驗中也選用四氫呋喃。四氫呋喃雖然是一個較理想的凝膠色譜用溶劑, 但是四氫呋喃貯存過程中, 尤其在光照條件下很容易生成過氧化物, 所以四氫呋喃要避光保存, 且使用前要純化。
5溶質的相關問題
5.1溶質樣品濃度
色譜圖有濃度依賴性, 當濃度增加時, 色譜圖的峰值將移向較高的淋出體積值, 濃度繼續增加時, 色譜圖會發生變形和拖尾。因此要得到準確的分子量分布和平均分子量, 進樣濃度應保持盡可能低, 否則需要將數據向無限稀釋外推。凝膠色譜操作在低濃度范圍時, 輸出信號與濃度呈線性關系, 不需對響應曲線作修正就能計算, 否則則不滿足線性關系, 需進行修正校訂[9]。有的研究者曾采用GPC (凝膠滲透色譜) 測定了MBS/PVC 共聚樹脂中PVC 的相對分子質量及其分布, 考察了樣品質量濃度在0.05～0.4 mg/mL 之間時濃度的變化對測定結果的影響。實驗結果表明:在低濃度范圍內, 隨著樣品濃度的增加, 測得的相對分子質量逐漸減小, 分布逐漸變寬[10]。
5.2溶質樣品的溶解時間
在相同的實驗條件下進樣分析, 發現不同溶解時間的GPC 色譜圖不同。溶解時間長時, 測得的數均相對分子質量、重均相對分子質量、黏均相對分子質量都要比溶解時間短時要大, 相對分子質量分布窄。從而說明, 采用GPC 法測定聚合物相對分子質量及其分布的結果與溶劑溶解時間有關, 溶解時間越長, 測得的相對分子質量越大, 這可能是由于溶解時間的延長使得大分子鏈充分伸展了。
5.3柱溫對實驗結果的影響
外部環境的溫度可能對實驗結果造成一定的影響, 所以為了減少其影響, 最好將儀器放置在高于環境溫度的恒溫環境中, 即保持柱溫不變[11]。柱溫不同, 柱效也是有區別的, 隨著柱溫的升高, 柱效有一定程度的提高。原因可能是柱溫升高會使凝膠溶脹充分, 聚合物分子在溶劑中良好地溶解, 凝膠的吸附效應減少, 溶劑黏度降低, 試樣的擴散速度增加。但是實驗室教學條件有限, 實驗在室溫下進行操作, 由于室溫不是恒定不變的, 所以對結果會造成一定的影響。
6結束語
液相凝膠色譜和任何一種常用的分析方法一樣, 都不是十全十美的, 也有它自己的局限性, 最主要的缺點是它的峰容量較小以及不能分離具有相同或非常相似大小的分子, 且缺少通用型檢測器。這些缺點隨著高效凝膠填料的出現而逐漸得到一定程度的彌補。凝膠色譜法對于解決實際分析的問題仍需要我們繼續探索。
